Ajọ fluorescence jẹ paati pataki ninu maikirosikopu fluorescence.Eto aṣoju ni awọn asẹ ipilẹ mẹta: àlẹmọ ayọ, àlẹmọ itujade ati digi dichroic kan.Wọn ti wa ni papọ ni cube kan ki a fi ẹgbẹ naa sii papọ sinu maikirosikopu.
Bawo ni àlẹmọ fluorescence ṣiṣẹ?
Simi Ajọ
Awọn asẹ igbadun n tan ina ti iwọn gigun kan pato ati dina awọn gigun gigun miiran.Wọn le ṣee lo lati ṣe agbejade awọn awọ oriṣiriṣi nipa yiyi àlẹmọ lati gba awọ kan laaye nipasẹ.Awọn asẹ ayọ wa ni awọn oriṣi akọkọ meji - awọn asẹ gigun gigun ati awọn asẹ kọja ẹgbẹ.Awọn exciter jẹ maa n kan bandpass àlẹmọ ti o koja nikan awọn wefulenti o gba nipasẹ awọn fluorophore, bayi dindinku yiya ti awọn orisun miiran ti Fuluorescence ati ìdènà simi ina ninu awọn fluorescence itujade band.Gẹgẹbi a ti fihan nipasẹ laini buluu ni nọmba, BP jẹ 460-495, eyi ti o tumọ si pe o le kọja nipasẹ itanna ti 460-495nm nikan.
O ti gbe laarin ọna itanna ti maikirosikopu fluorescence ati ṣe asẹ jade gbogbo awọn gigun gigun ti orisun ina ayafi fun sakani simi fluorophore.Gbigbe ti o kere ju àlẹmọ n ṣalaye imọlẹ ati didan awọn aworan.O kere ju 40% gbigbe fun eyikeyi àlẹmọ simi ni a ṣeduro iru gbigbe jẹ pipe> 85%.Awọn bandiwidi ti awọn simi àlẹmọ yẹ ki o wa ni o šee igbọkanle laarin awọn fluorophore excitation ibiti o bi awọn aarin wefulenti (CWL) ti awọn àlẹmọ jẹ bi sunmo bi o ti ṣee si awọn tente oke excitation wefulenti ti fluorophore.Awọn simi àlẹmọ opitika iwuwo (OD) pàsẹ awọn isale image òkunkun;OD jẹ wiwọn ti bawo ni àlẹmọ daradara ṣe dina awọn gigun gigun ni ita ibiti gbigbe tabi bandiwidi.OD ti o kere ju ti 3.0 ni a ṣe iṣeduro ṣugbọn OD ti 6.0 tabi tobi julọ jẹ apẹrẹ.
Ajọ itujade
Awọn asẹ itujade jẹ idi ti gbigba imole ti o wuyi lati inu ayẹwo lati de ọdọ aṣawari naa.Wọn ṣe idiwọ awọn iwọn gigun kukuru ati ni gbigbe giga fun awọn iwọn gigun gigun.Iru àlẹmọ naa tun ni nkan ṣe pẹlu nọmba kan, fun apẹẹrẹ BA510IF ninu eeya (àlẹmọ idena kikọlu), yiyan naa tọka si gigun ni 50% ti gbigbe ti o pọju.
Awọn iṣeduro kanna fun awọn asẹ ayọ mu otitọ fun awọn asẹ itujade: gbigbe kere ju, bandiwidi, OD, ati CWL.Àlẹmọ itujade pẹlu CWL ti o dara julọ, gbigbe ti o kere ju, ati apapọ OD n pese awọn aworan ti o ṣeeṣe ti o tan imọlẹ julọ, pẹlu idinamọ ti o jinlẹ julọ, ati rii daju wiwa awọn ifihan agbara itujade ti o kere ju.
Dichroic digi
Dichroic digi ti wa ni gbe laarin awọn excitation àlẹmọ ati itujade àlẹmọ ni a 45 ° igun ati ki o tan imọlẹ awọn simi ifihan agbara si ọna fluorophore nigba ti gbigbe ifihan agbara itujade si awọn oluwari.Awọn asẹ dichroic ti o dara julọ ati awọn pipin ina ina ni awọn iyipada didasilẹ laarin iṣaro ti o pọju ati gbigbejade ti o pọju, pẹlu> 95% irisi fun bandiwidi ti àlẹmọ ayọ ati gbigbe ti> 90% fun bandiwidi ti àlẹmọ itujade.Yan àlẹmọ pẹlu igbi ikorita (λ) ti fluorophore ni lokan, lati dinku ina-ina ati iwọn ifihan ifihan aworan fluorescent ga si ipin-ariwo.
Dichroic digi ni nọmba yii ni DM505, nitorinaa ti a npè ni nitori 505 nanometers jẹ iwọn gigun ni 50% ti gbigbe ti o pọju fun digi yii.Iwọn gbigbe fun digi yii ṣe afihan gbigbe giga loke 505 nm, gbigbe giga ni gbigbe si apa osi ti 505 nanometers, ati afihan ti o pọju si apa osi ti 505 nanometers ṣugbọn tun le ni diẹ ninu gbigbe ni isalẹ 505 nm.
Kini iyato laarin gun kọja ati iye awọn asẹ?
Awọn asẹ Fluorescence le pin si awọn oriṣi meji: gigun gigun (LP) ati kọja band (BP).
Awọn asẹ gigun gigun n gbejade awọn iwọn gigun gigun ati dina awọn ti o kuru.Gige-lori wefulenti ni iye ni 50% ti gbigbe tente oke, ati gbogbo awọn wefulenti loke awọn ge-lori ti wa ni gbigbe nipasẹ awọn gun kọja Ajọ.Nigbagbogbo wọn nlo ni awọn digi dichroic ati awọn asẹ itujade.Awọn asẹ Longpass yẹ ki o lo nigbati ohun elo ba nilo ikojọpọ itujade ti o pọju ati nigbati iyasoto iwoye ko ṣe iwulo tabi pataki, eyiti o jẹ ọran gbogbogbo fun awọn iwadii ti o ṣe agbejade ẹya kan ti njade ni awọn apẹẹrẹ pẹlu awọn ipele kekere ti isale autofluorescence.
Awọn asẹ iwe kọja ẹgbẹ nikan n atagba ẹgbẹ wefulenti kan, ati dina awọn miiran.Wọn dinku crosstalk nipa gbigba nikan ni okun to lagbara ti awọn fluorophore itujade julọ.Oniranran lati wa ni gbigbe, din autofluorescence ariwo ati bayi mu awọn ifihan-si-ariwo ratio ni ga lẹhin autofluorescence awọn ayẹwo, eyi ti gun kọja Ajọ ko le pese.
Bawo ni ọpọlọpọ awọn iru ti awọn eto àlẹmọ fluorescence BestScope le pese?
Diẹ ninu awọn iru asẹ ti o wọpọ pẹlu buluu, alawọ ewe, ati awọn asẹ ultraviolet.Bi o han ni tabili.
| Ajọ Ṣeto | Simi Ajọ | Dichroic digi | Ajọ Idankan duro | LED atupa Ipari igbi | Ohun elo |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485nm | · FITC: Fluorescent antibody ọna · Osan acid: DNA, RNA · Auramine: Tubercle bacillus · EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | DM570 | BA575 | 535nm | · Rhodamine, TRITC: Fluorescent antibody ọna · Propidium iodide: DNA · RFP |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365nm | · Aifọwọyi-fluorescence akiyesi · DAPI: abawọn DNA · Hoechest 332528, 33342: ti a lo fun abawọn Chromosome |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405nm | · Catecholamines · 5-hydroxy tryptamine · Tetracycline: Egungun, Eyin |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640nm | · Cy5 · Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
Awọn eto àlẹmọ ti a lo ni awọn ohun-ini fluorescence jẹ apẹrẹ ni ayika awọn iwọn gigun pataki ti a lo ninu awọn ohun elo fluorescence, eyiti o da ni ayika awọn fluorophores ti a lo julọ.Fun idi eyi, wọn tun jẹ orukọ lẹhin fluorophore ti wọn pinnu fun aworan, gẹgẹbi DAPI (bulu), FITC (alawọ ewe) tabi TRITC (pupa) awọn cubes àlẹmọ.
| Ajọ Ṣeto | Simi Ajọ | Dichroic digi | Ajọ Idankan duro | LED atupa Ipari igbi |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485nm |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365nm |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535nm |
| FL-Auramine | BP470 | DM480 | BA485 | 450nm |
| Texas Red | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560nm |
| mCherry | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560nm |
Bawo ni o ṣe yan àlẹmọ fluorescence?
1. Ilana ti yiyan àlẹmọ fluorescence ni lati jẹ ki itanna fluorescence / ina itujade kọja nipasẹ opin aworan bi o ti ṣee ṣe, ki o si dina imọlẹ ina ni kikun ni akoko kanna, ki o le gba ifihan agbara-si-ariwo ti o ga julọ.Paapa fun awọn ohun elo ti multiphoton excitation ati lapapọ ti abẹnu otito maikirosikopu, awọn ailagbara ariwo yoo tun fa nla kikọlu si awọn aworan ipa, ki awọn ibeere fun ifihan agbara si ariwo ratio jẹ ti o ga.
2. Mọ awọn simi ati itujade julọ.Oniranran ti fluorophore.Lati kọ eto àlẹmọ fluorescence kan ti o ṣe agbejade didara giga, aworan itansan giga pẹlu abẹlẹ dudu, inudidun ati awọn asẹ itujade yẹ ki o ṣaṣeyọri gbigbe giga pẹlu ripple iwọle kekere ti o kere ju lori awọn agbegbe ti o baamu si awọn oke itusilẹ fluorophore tabi awọn itujade.
3. Ro awọn agbara ti fluorescence Ajọ.Awọn asẹ wọnyi gbọdọ jẹ alailewu si awọn orisun ina gbigbona ti o ṣe ina ultraviolet (UV) ti o le ja si “iná”, ni pataki ti àlẹmọ exciter bi o ti tẹriba ni kikun kikankikan ti orisun itanna.
Awọn Aworan Ayẹwo Fuluorisenti Iyatọ
Awọn orisun naa ni a gba ati ṣeto lori Intanẹẹti, ati pe wọn lo fun kikọ ati ibaraẹnisọrọ nikan.Ti irufin eyikeyi ba wa, jọwọ kan si wa lati parẹ.
Akoko ifiweranṣẹ: Oṣu kejila-09-2022